产品名称：猪传染性胸膜肺炎PCR检测试剂盒
产品货号：YQ-D-0549
包装规格：50T/盒
检测方法：实时荧光PCR法
储存及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12 个月。
适用仪器 ：ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量 PCR检测仪。
标本采集：对于急性呼吸道型的病禽，用棉拭子取气管渗出物，放于1mL50%甘油生理盐水中；对于刚扑杀的病禽，采取支气管和肺组织；对于肾型和产蛋下降型的病禽，应采取发病鸡的肾脏或输卵管。
保存和运输：
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
猪传染性胸膜肺炎PCR检测试剂盒的原理
本试剂盒采用TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对猪传染性胸膜肺炎特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR 技术对猪传染性胸膜肺炎的DNA或RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
试剂盒主要组成成分 包装规格 25T/盒 50T/盒 反应液 500μL×1管 500μL×2管 酶液 25μL×1管 50μL×1管 阳性质控品 50μL ×1管 50μL ×1管 阴性质控品 250μL ×1管 250μL ×1管
实时荧光PCR的特点
1. 灵敏度高，操作简便。
2. 节省时间。
3．准确性高，特异性好，假阳性低。
4．一管式荧光定量pcr检测，避免后续污染。
5.对原始材料质t要求低。
6. 仅供科研不得用于临床诊断使用。
使用方法
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术jian剪碎混匀后取 0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生
理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL离心管中，8000rpm离心 2min，取上清液 100μL于1.5mL离 心管中;棉拭子直接取 100μL于 1.5mL离心管中。
1.2.核酸提qu
推荐采用核酸提qu或纯hua试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提qu，请按照试剂说明书进行操作。
2.试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；反应管数每满10份，多配制1份），每测试反应体系配制如下表： 试剂 AIBV 反应液 酶液 用量 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。
3.加样（样本处理区）
将步骤1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.PCR扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；
荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None即可。
4.3推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否 3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是 
5.1结果分析条件设定
5.结果分析判定
设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的 start 值（一般可在 3~15范围内调节）、stop 值（一般可在5~20 范围内调节），以及Threshold的Value值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。
5.2结果判断
阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果Ct值>38或无 Ct 值。
6.质控标准
阴性质控品：Ct>38或无 Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct 值≤32；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.检测方法的局限性
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
注意事项
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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