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乙醛脱氢酶测定步骤

发布时间:2022-08-01   点击次数:314次

 

一、产品简介:

乙醛脱氢酶(ALDHEC  1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种,广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。主要作用是将乙醛氧化成乙酸,在酒精代谢中起主要作用。

本公司提供一种简单,快速,可靠的定量 ALDH 酶活性的方法。在这个测定中,乙醛被 ALDH 氧化产生 NADH,然后将无色探针还原成有色产物,在 450nm 处具有强吸光度, 即可得到乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性大小。

二、试剂盒的组成和配制:

试剂名称

规格

保存要求

备注

提取液

液体120mL×1 

4℃保存


试剂一

粉体 mg×1 

4℃保存

临用前离心或甩几下使粉体落入

底部,再加 2.1mL 蒸馏水溶解备用

试剂二

液体 2mL×1 

4℃保存


试剂三

液体 45mL×1 

4℃保存


试剂四

液体µL×1 

-20℃保存

临用前离心或甩几下使液体落入

底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用

标准品

粉体 mg×1 

4℃保存

若重新做标曲,则用到该试剂

三、所需的仪器和用品:

酶标仪、96 孔板、可调式移液器、研钵、天平、离心机、蒸馏水。

四、乙醛脱氢酶(ALDH)酶活测定:

建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、样本制备

① 组织样本

称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm4℃离心 10min 取上清置冰上待测。

【注】:若增加样本量,可按照组织质量g:提取液体积(mL) 15~10 的比例进行提取

② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。

2、上机检测:

① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 450nm

② 依次在 96 孔板中加入:

试剂名称(µL

测定管

对照管

样本

20

20

试剂一

10

10

试剂二

10

10

试剂三

150

160

试剂四

10


混匀,30s 时于 450nm 处读取各管吸光值 A130min 

读取各管吸光值 A2A=A2-A1)测定-A2-A1)对照(每个样本需做一个自身对照


【注】若A 值在零附近徘徊,可加大样本量如:40µL,则试剂三相应减少,或者延长反应时间 T,则改变后的样本体积 V1 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。

五、结果计算:






1、标准曲线:y = 0.0364x - 0.0069x  NADH 摩尔质量(nmoly ΔA


2、按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活(nmol/min/mg prot=[ΔA+0.0099÷0.1031]÷(Cpr×V1÷V) ÷T

= 16.17×(ΔA+0.0099÷Cpr

3、按样本质量计算

酶活定义:每克样品每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA+0.0099÷0.1031] ÷(W×V1÷V) ÷T

= 16.17×(ΔA+0.0099÷W

4、按液体体积计算

酶活定义:每毫升液体样本每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活(nmol/min/mL= [ΔA+0.0099÷0.1031] ÷V1÷T

= 16.17×(ΔA+0.0099

 

 

V---加入提取液体积,1 mL V1---加入样本体积,0.02 mL T----反应时间,30 min W 样本质量,g

Cpr 样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

 



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