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幽门螺旋杆菌(HP)核酸检测试剂盒实验步骤

发布时间:2022-07-29   点击次数:169次


【产品名称】

商品名称:幽门螺旋杆菌(HP)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name Helicobacter Pylori Detection KitReal-Time PCR Method

【包装规格】25T/盒、50T/

【预期用途】

本试剂盒适用于检测水样粪便,疑似污染的水、食物等样本中的幽门螺旋杆菌,用于幽门螺旋杆菌感染的辅 助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对幽门螺旋杆菌特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光 PCR 技术对幽门螺旋杆菌的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格

25T/

50T/

HP 反应液

500μL×1 

500μL×2 

酶液

25μL×1 

50μL×1 

HP 阳性质控品

50μL ×1 

50μL ×1 

阴性质控品

250μL ×1 

250μL ×1 

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005PLightCyclerBio-RadEppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

水样便取 0.5~1mL;疑似污染的食物取 1g

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1. 样品处理(样本处理区)

1.1 样本前处理

水样便 13000rpm 离心 2min,去尽上清;疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL  1.5mL 灭菌离心管中;疑似污染的水直接取 100μL 转入 1.5mL 灭菌离心管中

1.2 核酸提取

采用核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法进行核酸提取请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 NN=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 ,每测试反应体系配制如下表:

试剂

HP 反应液

酶液

用量(样本数为 N

19μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。

3. 加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4. PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL

荧光通道选择:检测通道(Reporter DyeFAM,淬灭通道(Quencher DyeNONEABI 系列仪器请勿选择 ROX

参比荧光,选择 None 即可。

 

4.3 推荐循环参数设置:

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95

2min

2

45 cycles

95

15sec

60

30sec

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500  仪器为例)

反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline  Start  值、End  值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 315End 值可设在 520,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线,点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性:检测通道 Ct ≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct >40 或无 Ct 值。

5.3 质控标准

阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct ≤32 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行;

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;

3. 反应液应避光保存;

4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

 


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