技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 >ELISA实验测定类型和操作步骤

ELISA实验测定类型和操作步骤

发布时间:2021-09-08   点击次数:594次

双抗体夹心法检测抗原

双抗体夹心法是检测抗原常用的方法,但要注意的是在一步法(待测抗原与酶标抗体一起加入反应)测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物"出现钩状效应,甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

双抗体夹心法的简要操作步骤为:
1)先加入抗体,使抗体固定结合于载体表面;
2)再加样品,使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物;
3)加酶标抗抗体(第二种动物抗抗原的酶标抗体);
4)加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗原的量成正比。

竞争法检测抗原

当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。方法的基本原理可见图2,经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为所要测定的未知抗原的量。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

竞争法的简要操作步骤:
1)先加入抗体,使抗体固定结合于载体表面;
2)加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗原混合物,同时做只加酶标抗原的对照组;
3)加入酶促反应底物,发生显色反应,对比实验组及对照组的显色差异,计算未知抗原的量。

双抗原夹心法检测抗体

双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

双抗原夹心法的简要操作步骤为:
1)先加入抗原,使抗体固定结合于载体表面;
2)再加样品,使目标检测抗体形成抗原-抗体复合物;
3)加酶标抗原;
4)加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗体的量成正比。

间接法检测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体(人免疫球蛋白),故称为间接法。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法的简要操作步骤:
1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原;
2)加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗-体复合物;
3)加酶标抗抗体;
4)加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗体的量成正比。

在线咨询
咨询热线

17317326113

[关闭]